مقاله بررسی میزان آدنوزین تری فسفات در اسپرم مولدین ماهی كفال در شرایط مختلف

چکیده:

کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلا تی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.:  هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی[1] در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش[2]های مختلف بوده است.:  بدین منظور میزان ATP اسپرم های:

1) نمونه های تازه در دماهای مختلف 10-12 درجه و 18-20 درجه سانتی گراد،

2) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف4 (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،

3) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک  65/0%)  به مدت 5 و 10 روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.

  بر اساس آزمایش های انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 10 تا 12درجه سانتیگراد 22/7 ±04/74%  غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 18 تا 20 درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای 4 درجه و دمای آزمایشگاه به مدت 6 ساعت به ترتیب   91/0 ±26/90%   و 49/1 ±17/17%  ATP  خود را حفظ کردند.

نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0% ) به مدت  5 روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک 65/0% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت 10 روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد.

 براساس نتایج بدست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی كفال طلایی  نمونه گیری در دمای 18-20 درجه و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.

واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP، 

مقدمه:

اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان  ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP  اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان           ATPاسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP  فراهم می شود.(1).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(2)  و میزان  ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (3) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP  سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP  هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان  ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهشATP  به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(2).  یك رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATP  و سرعت حركت اسپرم وجود دارد(4) آنزیم اصلی تبدیل انرژی شیمیایی گرادیان پروتون در سیستم بیولوژیكی ، ATP سنتتاز است. این آنزیم برای سنتز ATP از ADP و فسفات غیرآلی استفاده می كند ساختمان و عملكرد این آنزیم در گونه های مختلف یكسان است (5)  تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدارATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(6). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این پروژه سعی بر آن داشتیم که میزانATP  اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.

 مواد و روشها:

به منظور بیان میزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم های موجود در یك میلی لیتر از مایع اسپرم اخذ شده از 10 ماهی نر كفال طلایی ، به كمك لام نئوبار و میكروسكوپ نوری (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در این تحقیق جهت بررسی تاثیر دمای نمونه گیری و میزان ATP اسپرم ماهی ، نمونه گیری در دو دمای  ^◦C 10-12 و18-20 ^◦C انجام شد . ما در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت 100/1 در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده  سپس 50 از آن را با  50 از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر
 10^-19 mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده  و بصورت nmol/10⁸  اسپرم بیان کردیم.

 درجه حرارت نگهداری اسپرم ها بر میزان ATP سلول های مذكور تاثیرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسی دمای مناسب نگهداری ، اسپرم ها به مدت 6 ساعت در دمای  4 درجه و دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس میزان ATP آن ها مورد اندازه گیری قرار گرفت. معمولا برای نگهداری اسپرم از محلول های تداوم بخشExtenders )) استفاده می كنند این محلول ها سبب تداوم و حفظ فعالیت اسپرم ها در دوره نگهداری می شوند. به منظور بررسی بهترین محلول تداوم بخش ، محلول گلیسرول 10 درصد و گلوكز 0.3 مولار ، محلول نمك 0.7 درصد و محلول نمك 0.65 درصد مورد بررسی قرار گرفتند . میزان ATP اسپرم ها در محلول های مذكور پس از نگهداری اسپرم در دمای منفی 15 درجه در زمان های 5 و 10 روز مورد سنجش قرار گرفت.

جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان  1384از دریاچه خزر که دمای آب آن  18 تا 20^◦C و شوری آن  12 تا  13 ppm بود و همچنین در روز  17 آبان  1384 در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن 10  تا 12 ^◦C و شوری آن  12 تا ppm 13

 بود تعدادی ماهی کفال  طلایی صید کرده و پس از تعیین جنسیت، نمونه های نری را که هنوز اسپرم ریزی نکرده بودند انتخاب نموده و از بین آنها از 10 ماهی نر با طول تقریبی25  تا  30cm و وزن  900 تا  1100g نمونه گیری شد. بعد از نمونه گیری ، بلافاصله درب لوله های آزمایش توسط نوار پارافیلم محکم بسته شده و در جعبه یخ  4 ^◦C به آزمایشگاه منتقل شدند. در واقع اسمولالیته پائین ادرار با تحریک اولیه موجب کاهش اولیه ذخیره ATP سلولی و کاهش کیفیت اسپرم کپور می شود. لذا ما برای ممانعت از کاهش کیفیت اسپرم، در طول نمونه گیری از آلوده شدن اسپرم به ادرار و هر گونه ماده آلوده کننده ای جلوگیری کردیم.